Isolierung und Untersuchung der Pigmente in den Augen des Polychäten Platynereis dumerilii

 

Eigene Arbeiten

Inhaltsverzeichnis zu den Eigenen Arbeiten

 

 

 

3. Eigene Arbeiten

3.1. Einleitung

 

Das Ziel der Arbeit an den Augenfarbstoffen von Platynereis dumerilii war, die Struktur von Nerepterin und Platynerepterin zu erhellen. Die Struktur dieser beiden Pigmente interessierte im Hinblick auf die biogenetische Wirkungsweise im Pterinstoffwechsel von Platynereis dumerilii und deren or-Mutante.

Das Vorgehen in der Strukturaufklärung war gegeben durch die sehr beschränkte und schwierig zu beschaffende Menge an Naturprodukt. Es wurde versucht, nachdem die Pterinstruktur der beiden Pigmente feststand, durch Synthese von Modellverbindungen die mit Nerepterin und Platynerepterin grosse Ähnlichkeit hatten, die Struktur weiter einzuengen, und so weit wie möglich zu charakterisieren.

 

3.2. Aufarbeitung, Trennung und Isolierung von Nerepterin und Platynerepterin

 

Die zur Isolierung der Pigmente verwendeten Tiere stammten zum grössten Teil aus Wildfängen. Mit Hilfe von starken Halogenlampen, die in Küstennähe auf die Meeresoberfläche aufgelegt wurden, konnten die geschlechtsreifen Tiere in der Nacht angelockt werden (102).

 Der Fang von geschlechtsreifen Tieren erwies sich gegenüber dem Fang der noch nicht schwärmenden Tiere in zweierlei Hinsicht überlegen. Einerseits konnten die gesuchten Nereiden sehr selektiv gefangen werden und anderseits zeigte es sich, dass die Menge der gesuchten Pigmente in einem epitoken Tier ungefähr um den Faktor 5 gegenüber einem adulten Tier vergrössert war. Die Schwärmzeit der Tiere ist stark abhängig von der Mondphase.

So gelang es auf zwei Exkursionen in Banyuls-s-Mer innerhalb eines Mondzyklus, in den Nächten, 20 000 resp. 30 000 Tiere zu sammeln. Die Schwärmzeit der Tiere beschränkte sich auf die Zeit zwischen Sonnenuntergang und Mondaufgang und auf die Zeit zwischen Monduntergang und Sonnenaufgang.

Es handelte sich vorwiegend um drei Arten von Nereiden die gefangen wurden, nämlich um Platynereis dumerilii, Nereis rava und Nereis zonata.

Die in den zwei anderen Arten gefundenen Pigmente erwiesen sich mit dem Nerepterin und dem Platynerepterin identisch. Die gefangenen Tiere wurden sofort in Ethanol gegeben und innerhalb eines Monats dekapitiert.

Die zwei Augenpigmente der Tiere aus der ersten Exkursion wurden durch mehrfache Reinigungsoperationen an Cellulosesäulen, Ionentauschersäulen und mit Hilfe präparativer Papierchromatographie getrennt und isoliert. Die Isolierung der Pigmente nach der zweiten Exkursion konnte wesentlich vereinfacht werden. Nach Fraktionierung des Homogenisates der Tierköpfe über eine Cellulosesäule, konnte das Platynerepterin durch Umfällen rein erhalten werden. Das gelbe Nerepterin wurde nach einmaliger Trennung an einer SH-20 Sephadexsäule und Umfällen als reines Produkt erhalten.

Da sich Nerepterin in ammoniakalischem Milieu zu einem neuen Produkt umwandelt, wurde bei der Aufarbeitung der Naturprodukte Ammoniak vermieden.

 

3.3. Charakterisierung von Nerepterin und Platynerepterin

 

Das Nerepterin ist ein amorphes korngelbes Produkt welches durch Ausfällen aus konzentrierten Ameisensäurelösungen durch Verdünnen mit Wasser oder Ethanol erhalten wurde. Das Nerepterin ist unlöslich in allen üblichen organischen Lösungsmitteln und nur sehr schwer löslich in Wasser. In konzentrierter Ameisensäure ist es relativ gut löslich, fällt aber beim Verdünnen mit Wasser leicht wieder aus.

In 0,1 M Natronlauge ist, es sehr leicht löslich und während Tagen im Dunkeln stabil, zersetzt sich jedoch in dieser Lösung in Gegenwart von Licht sehr schnell.

Die intensive gelbgrüne Fluoreszenz des Nerepterins in Lösung und auf DC ist gleich wie die Fluoreszenz von Sepia- resp. Deoxysepiapterin [13] [14].

 

Das Platynerepterin ist ein indigoblaues amorphes Produkt, welches durch Ausfällen aus konzentrierter Ameisensäure durch geringes Verdünnen mit Wasser erhalten werden kann. Das Platynerepterin ist unlöslich in allen üblichen organischen Lösungsmitteln, völlig unlöslich in Wasser, selbst kaum löslich in konzentrierter Salzsäure, aber relativ gut löslich in konzentrierter Ameisensäure in der es sich mit schöner rubinroter Farbe und Fluoreszenz löst. Ohne Luftzufuhr ist es in dieser Ameisensäure, wie auch in Trifluoressigsäure recht stabil. Durch sorgfältiges Verdünnen der Lösungen in Ameisensäure mit Wasser kann ein sprunghafter Farbumschlag zu indigoblauer Lösung beobachtet werden.

Durch einen geringen Überschuss an Wasser fällt das Produkt als indigoblaues Produkt aus.

In Basen, wie z.B. 0,1 M Natronlauge ist das Produkt leicht löslich, wobei eine fluoreszierende, ziegelrote Lösung entsteht. Ohne Lichteinfluss bleibt das Produkt in dieser 0,1 M Natronlauge wie das Nerepterin über Tage stabil, zersetzt sich jedoch leicht an Tageslicht zu einer schwach gelblichen Lösung, die im UV Licht weisslich-blau fluoresziert. Auf Cellulose zeigt Platynerepterin einen substantiven Färbecharakter und ist weder mit Säuren noch mit konzentrierten Ammoniak Lösungen wieder vollständig eluierbar.

 

3.3.1. Physikalische und chemische Untersuchungen an Nerepterin und Platynerepterin.

 

3.3.1.1. Physikalische Eigenschaften

 

3.3.1.1.1.    Elektrophorese

Von den beiden Pigmenten zeigte nur das Nerepterin Wanderung auf Cellulose. Das Platynerepterin blieb bei allen pH-Werten unbeweglich (Figur 20).

 

 

Der isoelektrische Punkt von Nerepterin liegt bei pH 2,8

 

3.3.1.1.2. Spektren von Nerepterin und Platynerepterin

 

3.3.1.1.2.1. Elektronenspektren

Da die Molekularmassen von den Pigmenten unbekannt waren, wurden die Extinktionswerte für l%ige Lösungen mit einer Schichtdicke von 1 cm aufgezeichnet (Figur 21 und Figur 22).

 

 

 

Wenn die Lösung von Platynerepterin in konzentrierter Ameisensäure vorsichtig mit Wasser verdünnt wurde, änderte sich die Farbe der Lösung zu einem intensiven Blau (Figur 23)

 

 

3.3.1.1.2.2. ¹H-NMR Spektren

Als Folge von Substanzmangel und auf Grund der schlechten Löslichkeit der Produkte konnten FT-NMR Spektren nur in Trifluoressigsäure erhalten werden (Figur 24 und Figur 25).

 

 

 

 

3.3.1.1.2.3. Massenspektren

Die beiden Pigmente zeigten unterhalb 270° Celsius keinen Schmelzpunkt. Diese Eigenschaft drückte sich auch in den Massenspektren aus. Von Nerepterin konnte kein MS aufgenommen werden, Vom Platynerepterin konnte bei 385 m/e ein deutliches Signal beobachtet werden. (Figur 26).

 

 

 

3.3.2. Chemische Abbaureaktionen

 

3.3.2.1. Verbrennungsanalyse

Die bei einer Temperatur von 120° C und einem Druck von 0,02 Torr während 3 Stunden getrockneten Naturprodukte ergaben bei der Verbrennungsanalyse die in Tabelle 10 aufgeführten Werte.

 

Tabelle 10

 

 

3.3.2.2. Oxidation in saurem Milieu an Luft

 

Nach längerem Stehen lassen einer 50%-igen Ameisensäurelösung von Platynerepterin an der Luft, konnten dünnschichtchromatographisch 11 verschiedene, zum Teil fluoreszierende Abbauprodukte nachgewiesen werden.

Eines der 4 fluoreszierenden Produkte konnte als Leukopterin [4] identifiziert werden, sowohl durch Dünnschichtchromatographieund Elektrophorese als auch durch Elektronenspektren.

Nerepterin erwies sich unter diesen Bedingungen als stabil.

 

 

3.3.2.3. Verhalten in basischem Milieu und unter Lichteinfluss

In der Dunkelheit waren das Nerepterin und das Platynerepterin in 1,0 M Natriumhydroxidlösung relativ stabil. So konnte nach 1 tägigem Stehen lassen einer 1,0 M Lösung keine Änderung der Elektronenspektren festgestellt werden. Sobald jedoch die Lösungen an Licht aufbewahrt wurden, zersetzten sich die Produkte schnell zu leicht gelblichen, bläulich fluoreszierenden Lösungen. An direktem Sonnenlicht war nach ca. 1 Stunde kein Ausgangsprodukt mehr sichtbar.

 

Dünnschichtchromatographisch konnte als Abbauprodukt des Platynerepterins die Xanthopterin-7-carbonsäure [41]oder eine damit sehr verwandte Verbindung wahrscheinlich gemacht werden.

 

Es zeigte sich, dass beim Isolieren des Abbauproduktes des Platynerepterins die Fluoreszenz des zuerst gelb erscheinenden Produktes in ein intensives Blau überging, sobald Ammoniak zur Aufarbeitung verwendet wurde. Dasselbe Verhalten konnte auch bei der Xanthopterin-7-carbonsäure [41] nachgewiesen werden.

Synthesen dieses blau fluorezierenden Produktes durch Stehen lassen der Xanthopterin-7-carbonsäure [41] in konzentriertem Ammoniak an Luft, zeigten die Bildung von 7-Aminoxanthopterin [42].

Die Strukturaufklärung von 7-Aminoxanthopterin [42] wurde anhand von NMR, MS, UV und CHN-Analyse durchgeführt.

 

 

3.3.2.4. Oxidation mit Kaliumpermanganat

Wenn Platynerepterin und Nerepterin, welche in 0,1 M Natronlauge gelöst waren, mit einem geringen Überschuss an verdünnter Kaliumpermanganatlösung versetzt wurden, konnte bei beiden ein identisches blauviolett fluoreszierendes Abbauprodukt nachgewiesen werden. Dünnschichtchromatographisch erwiesen sich die Abbauprodukte als identisch.

 

Wenn Platynerepterin mit einem geringen Unterschuss an Kaliumpermanganatlösung versetzt wurde, konnten 8 fluoreszierende Produkte dünnschichtchromatographisch festgestellt werden. Die Identifizierung der Produkte gelang nicht.

 

3.3.2.5. Ozonolyse der Pigmente

Platynerepterin wurde in Ameisensäure gelöst und ein Überschuss an Ozon durchgeleitet. Die Lösung färbte sich gelb und wurde nach oxidativer Ozonidspaltung untersucht. Es wurden 2 Abbauprodukte gefunden: Ein wie Nerepterin gelbgrün fluoreszierendes Produkt, das im sichtbaren Bereich ein ähnliches Spektrum (Figur 27) hatte wie Nerepterin nach Periodatspaltung oder das mit NaBH₄ reduzierte Platynerepterin. Das andere Produkt war ein blau fluoreszierendes Produkt in geringer Menge.

 

 

Bei der Ozonolyse von Nerepterin, die auf die gleiche Art wie die des Platynerepterins durchgeführt wurde, konnte selbst bei 10 fachem Ozonüberschuss keine Veränderung des Ausgangsproduktes festgestellt werden.

 

3.3.2.6. Reduktion mit Natriumborhydrid

Platynerepterin konnte mit Natriumborhydrid, welches im Überschuss zu einer basischen Lösung gegeben wurde, zu einem gelben Produkt reduziert werden, das ein dem Nerepterin beinahe identisches UV-Sichtbarspektrum aufwies. Die Reduktion des Platynerepterins konnte Aufnahmen von Elektronenspektren verfolgt werden. Es zeigten sich stabile isosbestische Punkte (Figur 28). Im Gegensatz zu Nerepterin war das reduzierte Platynerepterin in saurer Lösung jedoch nicht stabil und wurde vollständig wieder zum Platynerepterin zurückoxidiert.

 

 

Das Nerepterin wurde unter den Bedingungen bei denen das Platynerepterin mit Natriumborhydrid reduziert wurde, nicht reduziert.

 

3.4. Zur Struktur von Nerepterin und Platynerepterin

3.4.1. Diskussion der Spektren

 

3.4.1.1. Elektronenspektren

Auffällig an den Elektronenspektren von Platynerepterin und Nerepterin sind die bei beiden Verbindungen ausgeprägt in stark sauren Lösungsmitteln vorkommenden Doppelmaxima bei 430 nm und 458 nm bei Nerepterin und 508 nm und 543 nm bei Platynerepterin. In Tabelle 11 sind die Charakteristika dieser Spektren und die einiger weiterer natürlichen Pterinpigmente aufgezeichnet.

 

Tabelle 11

 

 

Vergleiche der Sichtbarspektren des Platynerepterins mit denen des Pterorhodin [12] zeigten eine grosse Ähnlichkeit. Vor allem zeigen die beiden Produkte in saurem Lösungsmittel ähnliche Spektren (Figur 29)

 

 

Ein grösserer Unterschied zwischen den beiden Produkten zeigte sich erst in basischem Milieu (Figur 30).

 

 

Die Frage nach der Art des in Pterorhodin [12] und eventuell auch in Platynerepterin vorliegenden Chromophors wurde mit Hilfe einer Modellverbindung zu lösen versucht. So wurde das Kondensationsprodukt [122] von 2-Methylchinoxazolon [120] und Chinoxazolon [121] - analog der Synthese der Pterorhodins [12] aus 7-Methylxanthopterin [8] und Xanthopterin [6] (105) - synthetisiert.

 

 

Die Ausgangsprodukte wurden nach einer Vorschrift von Hinsberg synthetisiert (106).

Das gebildete Kondensationsprodukt [122] war ein gelbes Produkt, das durch Zugabe von Säure in ein intensiv rot gefärbtes Produkt umgewandelt wurde. Durch Verdünnen mit Wasser wurde wieder das gelbe Produkt erhalten. Die Elektronenspektren der protonierten Form des Kondensationsproduktes [122] sind denen des Pseudoisozyanins [123] sehr ähnlich (Figur 31) (107).

 

 

Elektronenspektren des Kondensationsproduktes [122] wurden in unterschiedlich starken Säuren aufgezeichnet (Figur 32).

 

 

Gleiches optisches Verhalten wie das Kondensationsproduktes [122], zeigte auch das Kondensationsprodukt [124] von Xanthopterin [6] mit 2-Methylchinoxazolon [120], welches in saurem Milieu rot, in basischem gelb war (Figur 33).

 

 

Dieses Kondensationsprodukt [124] wurde ebenfalls erhalten, wenn Erythropterin [10] mit o-Phenylendiamin kondensiert wurde (108).

 

 

Das Pterorhodin [12] zeigte ein zum Kondensationsprodukt [124] unterschiedliches Verhalten. In Säure war das Produkt stabil und zeigte die bekannte rote Farbe. Wenn das Produkt in Base gemessen wurde, konnte gleich nach dem Lösen noch ein rotes Produkt gemessen werden, welches aber nach ca. 15 Minuten in ein neues Produkt umgewandelt wurde, welches aber wiederum zu wenig stabil war, um in grossen Mengen isoliert zu werden (Figur 34). Durch Ansäuern der Lösung konnte wieder das Pterorhodin [12] erhalten werden.

Wenn das Zwischenprodukt zu lange Stehen gelassen wurde, konnte als Abbauprodukt nur noch das Leukopterin [4] und das 7-Methylxanthopterin [8] erhalten werden.

 

 

Da die Kondensationsprodukte [122] und [124] erst durch Protonierung die rote Farbe erhalten, kann angenommen werden, dass bei Pterorhodin [12] auch eine ähnliche Gruppierung vorliegen müsste.

Möglich beim nicht protonierten Pterorhodin [12] wäre die Struktur [126] mit einem Proton zwischen den beiden N(8)-Atomen oder beim protonierten Pterorhodin eine Struktur [127] wie sie z.B. bei den Neutrocyaninen angenommen wird.

 

 

Ein nukleophiler Angriff durch Donatormoleküle würde leicht in a-Stellung der Cyaninkette erfolgen (109).

 

 

Bei weiteren 7-substituierten Xanthopterinderivaten konnte dasselbe spektroskopische Verhalten in Säure beobachtet werden. So zeigte das Lepidopterin [11] in Base ein Absorptionsmaximum bei 460 nm, in Säure dagegen ein Doppelmaximum bei 453 nm und 487 nm.

Da das Lepidopterin [11] äusserst schwierig rein zu isolieren war, wurde zuerst ein stabileres Produkt [125] synthetisiert, indem Erythropterin [10] mit Ethylendiamin versetzt wurde und so ein Produkt [125] erhalten wurde, das stabil in Säure und Base war und ein dem Lepidopterin [11] analoges optisches Verhalten zeigte. Dasselbe Produkt [125] wurde auch erhalten durch Kondensation von Xanthopterin [6] mit 3 Methyl-5,6-dihydro-(1H)-pyrazin-2-on [126].

 

 

In Base zeigt das Produkt [125] ein l_Max von 468 nm. Das durch Ameisensäure protonierte Produkt [125] (Figur 35) zeigt ein Doppelmaximum bei 471 nm und 495 nm.

 

 

Diese tautomere Struktur kann für Lepidopterin [11] schon in neutraler Lösung vorkommen, wenn man berücksichtigt, dass das Proton von der Carbonsäure an die basischste Stelle im Molekül verschoben werden kann, so dass ein Zwitterion vorläge (Figur 36).

 

 

Verbindungen mit der Grundstruktur [128] zeigten in Säure ebenfalls einen bathochromen Schift, jedoch genügt in diesen Fällen Ameisensäure nicht, sondern Protonierung der weniger basischen Produkte als z. B. Lepidopterin [11] erfolgte erst in Schwefelsäure.

 

 

In der nachfolgenden Tabelle 12 sind die Daten aus den Elektronenspektren zusammengestellt.

 

Tabelle 12

 

 

Vorschläge und Arbeiten über die Struktur des Erythropterins [10] wurden 1962 und 1963 von 2 verschiedenen Arbeitsgruppen unternommen. So erklärte Pfleiderer als die wesentliche Veränderung des Erythropterin-Chromophors gegenüber dem des 7-Methylxanthopterins [8] die Enolisierung in der Seitenkette, was eine Verlängerung des konjugierten Systems ergibt, wie die Struktur [131] zeigt (110).

 

 

Die andere Arbeitsgruppe (111) schlug eine exozyclische Doppelbindung an der 7-Stellung als den entscheidenden Unterschied des Chromophors des Erythropterins [10] und des 7-Acetonylxanthopterins [133] gegenüber dem des 7-Methylxanthopterins [8] vor.

 

 

Für den Chromophor und die Struktur der protonierten Formen dieser Verbindungen könnte man die in Figur 37 für Erythropterin [10] angegebenen Strukturen annehmen.

Die erste Protonierung tritt bei Xanthopterin [6] und Xanthopterinderivaten an N(1) ein, die zweite am N(8) (112). Es kann angenommen werden, dass das Erythropterin [10] als Neutralmolekül als Ampholyt vorliegen könnte (pK_i = 1), wobei die erste Protonierung dann am Carbonsäureanion stattfinden könnte.

 

 

Eine exozyclische Doppelbindung kann auch für die protonierte Form des Kondensationsproduktes [139] aus Xanthopterin [6] und Acetophenon auf Grund der UV-Sichtbarspektren angenommen werden.

 

§

Dasselbe Produkt [139] wurde auch von Iwanami und Seki 1972 (113) durch Kondensation von 2, 5, 6-Triamino-4-hydroxypyrimidin-sulphat mit Benzoylbrenztraubensäureethylester synthetisiert. Sie erhielten ein oranges Produkt mit einem l_max in 0.1 M Natronlauge von 422 nm (Das von uns synthetisierte Produkt zeigte ein l_max in 0.1 M Natronlauge von 479 nm!), dem Sie auf Grund des NMR-Spektrums in Schwefelsäure die schon von W. v. Philipsborn, H. Stierlin und W. Traber (117) vorgeschlagene Enaminstruktur gaben. Als Begründung des Vorschlages wurde das Fehlen eines Signals zwischen 0 bis 7,17 ppm angegeben. Eine Enolform wurde ausgeschlossen, da die bei tiefstem Feld erscheinenden aromatischen Protonen bei 8,3 ppm erschienen und somit ortho zu einer Carbonylgruppe stehen mussten.

 

Ein weiteres Xanthopterinderivat wurde von uns synthetisiert, welches einen ausgeprägten bathochromen Schift in Schwefelsäure zeigte. Es handelte sich um das Kondensationsprodukt [141] von 7-Methylxanthopterin [8] mit Benzaldehyd. Dasselbe Produkt [141] wurde auch durch Reduktion des Kondensationsproduktes [139] mit Natriumborhydrid und anschliessender Wasserabspaltung erhalten.

 

 

In 0,1 M Natronlauge zeigte das Produkt ein Absorptionsmaximum bei 452 nm, in  Ameisensäure eines bei 430 nm und in Schwefelsäure ein Doppelmaximum bei 515 nm und 547 nm.

Als Erklärung dieses bathochromen Schiftes um mehr als 100 nm könnte das in Schwefelsäure durch Protonierung gebildete Produkt [142] vorgeschlagen werden.

 

 

Zwei weitere von uns synthetisierte Produkte, das 7-Propyl-1-en-xanthopterin [143] und das Dehydroekapterin [144] zeigten in Säuren keinen bathochromen Schift wie das 7-Styrylxanthopterin [141], da die positive Ladung an N(8) die durch die Protonierung entstand, nicht delokalisiert werden kann.

Synthetisiert wurde das 7-Propyl-1-en-xanthopterin [143] durch Reduktion des 7-Acetonylxanthopterins [133] mit Natriumborhydrid und anschliessender Wasserabspaltung in Säure. Das Dehydroekapterin [144] wurde sowohl erhalten durch Reduktion des Erythropterins [10] mit Natriumborhydrid zum Ekapterin [9] und anschliessender Wasserabspaltung, als auch durch Kondensation von 7-Methylxanthopterin [8] mit Glyoxylsäurealdehyd in Säure, wobei als Nebenprodukt auch Ekapterin [9] erhalten werden konnte.

 

 

3.4.1.2. ¹H-NMR Spektren

 

Die Spektren der Augenpigmente sind nicht eindeutig interpretierbar auf Grund der schlechten Auflösung der Signale. Eine Verwandtschaft zwischen den beiden Pigmenten, unter Berücksichtigung der Indizien aus anderen Analysen, kann als gesichert gelten (Tabelle 13).

 

Tabelle 13

 

Lage der Signale in Trifluoressigsäure (ppm)

 

 

Unter der Annahme, dass das Nerepterin und das Platynerepterin entweder zu den Xanthopterinderivaten oder den 7,8-Dihydropterinderivaten zuzuordnen sind, wie dies bisher für alle natürlichen farbigen Pterine der Fall war, könnte man folgende Strukturelemente annehmen:

Das Singulett bei 8,26 ppm bei Platynerepterin und bei 8,23 ppm bei Nerepterin könnte den C(2)-NH-Protonen entsprechen, die bei Xanthopterin [6] in TFS bei 8,35 ppm erscheinen (in FSA bei 7,5-7,7 ppm). In diesem Bereich findet man auch das Vinylproton des Pterorhodins [12], das in Schwefelsäure bei 8,15 und in FSA bei 8,19 ppm erscheint. Das Vinylproton des Erythropterins [10] liegt in TFS bei 7,44 ppm, während die C(2)-NH-Protonen nicht sichtbar sind. Die Lage der Signale im Bereich von 2,95 bis 4,49 ppm entspricht dem Bereich der Methen- und Methinprotonen in polyhydroxylierten Ketten wie sie im Nerepterin durch Periodatspaltung wahrscheinlich gemacht ist. Bei 4,63 ppm erscheinen aber auch die Protonen in 7-Stellung des Deoxysepiapterins [14], bei 3,48 ppm - 4,72 ppm diejenigen der Drosopterine. Die bei beiden Pigmenten auftretenden Signale bei 1,41 ppm resp. bei 1,46 ppm entsprechen denen von Methylgruppen von Ethylgruppierungen. Ob diese Signale tatsächlich zu den Naturprodukten gehören ist nicht zu entscheiden, doch kennt man diese Signallagen z.B. für Deoxysepiapterin [14], wo die Methylgruppe bei 1,22 ppm erscheint. Nicht auszuschliessen ist, dass Ethanol, welches die beim Isolieren der Substanzen verwendet wurde fest an die Produkte gebunden wurde, wie dies häufig bei Pterinen mit Wasser geschieht.

Ob die untersuchten Naturprodukte entweder zu der Gruppe der Xanthopterinderivate oder zur Gruppe der 6-substituierten 7,8-Dihydroderivate gehört, kann anhand dieser NMR Spektren nicht entschieden werden.

 

 

3.4.1.3. MS Spektren

 

Der einzige schwache Anhaltspunkt den man aus dem Massenspektrum von Platynerepterin mitnehmen kann, ist die Annahme, dass der Peak bei 385 m/e der Molekularpeak oder ein Bruchstück des Platynerepterins ist.

Da die natürlichen farbigen Pterine sehr schwer verdampfen, gelangen bis heute zur wenige Massenspektren. So ist lediglich das MS des Sepiapterins [13] (114) und das MS des silylierten Xanthopterins (115) beschrieben. Im Verlaufe der Arbeit gelang uns, vom Xanthopterin [6] und einigen synthetisierten Derivaten, Massen-Spektren aufzunehmen. Auch gelang die Aufnahme des Massenspektrums von Erythropterins [10] selbst.

Das Nerepterin selbst lieferte kein Spektrum.

 

 

3.4.2. Zur Struktur des Chromophors der in 7-Stellung substituierten Xanthopterine

 

Da die Elektronenspektren des Nerepterins und des Platynerepterins starke Ähnlichkeiten mit protonierten Formen von in 7-Stellung substituierten Xanthopterinderivaten aufwiesen, wurde versucht, die Struktur dieser Verbindungen zu erfassen. Dazu wurden einige Modellverbindungen NMR spektroskopisch in Trifluoressigsäure (TFS) und Fluorsulfonsäure (FSA) untersucht, und mit den Elektronenspektren in den entsprechenden Lösungsmitteln verglichen.

Als einfachste Modellverbindung wurde das 7-Methylxanthopterin [8] genommen. Die NMR-Spektren sind in der Figur 38 aufgezeichnet.

 

 

Wenn das 7-Methylxanthopterin [8] einige Stunden in der FSA stehengelassen wird, ändert sich das NMR-Spektrum (Figur 39)

 

 

Als mögliche neu entstandene Verbindung ist ein 7-Sulphomethylxanthopterin anzunehmen, wie dies von Tschesche und Schäfer vorgeschlagen und untersucht worden ist (116).

Gleiches Verhalten wie 7-Methylxanthopterin [8] zeigen auch das 7-Ethylxanthopterin (Figur 40) und das 7-Propylxanthopterin (Figur 41).

 

 

 

 

Anhand des Protonierungsschemas für Xanthopterin [6], kann auch für die Protonierung der 7-alkylsubstituierten Produkte der folgende Verlauf angenommen werden:

 

 

Das 7-Isopropylxanthopterin zeigt ein von den anderen Produkten verschiedenes Verhalten. So zeigt sich bei diesem Produkt in FSA eine langsame Veränderungen in dem NMR-Spektrum (Figur 42)

 

 

Die Veränderungen könnten dahin interpretiert werden, dass bei diesem Produkt wirklich eine exozyklische Doppelbindung vorliegen müsste und eine Sulfomethylierung an der Methylgruppe eintritt.

 

Beim Übergang zu Verbindungen mit Seitenketten die eine funktionelle Gruppe tragen, werden die Aussagen über die Struktur, resp. den Chromophor des Systems noch schwieriger. So wurden von Philipsborn, Stierlin und Traber 1963 (117) für das 7-Acetonylxanthopterin [133] und das Erythropterin [10] in neutraler und saurer Lösung die folgenden tautomeren Strukturen vorgeschlagen:

 

 

1963 schlugen Merlini, Philipsborn und Viscontini noch für weitere Xanthopterinderivate tautomere Strukturen vor (118). Für Xanthopterinessigsäureethylester [146] in neutralem Milieu (DMSO) die Struktur a). In Trifluoressigsäure die Struktur b) die in einem 1:1 Verhältnis mit der Struktur a) vorliegt.

 

 

 

Wenn wir 7-Acetonylxanthopterin [133] in d-Trichloressigsäure lösten, konnte beobachtet werden, dass das Vinylproton bei 6,72 ppm verschwand, das Methylproton hingegen unverändert erhalten blieb. Dieser Austausch lässt sich anhand des folgenden Schemas erklären.

 

 

Wobei sich die Frage stellen würde, weshalb nicht auch die Methylprotonen austauschen könnten, wenn man zu der exozyklischen Doppelbindung noch eine dazu konjugierte Enolbildung annehmen könnte.

 

 

Bei der von uns untersuchten zweifachprotonierten Form des 7-Acetonylxanthopterins [133] in FSA zeigte sich folgendes Verhalten. Sofort nach Auflösung zeigten sich zwei Formen, von denen die eine nach 5 Stunden beinahe vollständig verschwunden war (Figur 43). Erstaunlicherweise blieb das Verhältnis der Vinylprotonen zu den Methylprotonen konstant 1:3.

 

 

Als mögliche Verbindung die in FSA entsteht, kann z.B. eine Veresterung der Enolform vermutet werden, obwohl in diesem Falle eine Allylkopplung im NMR sichtbar sein sollte. Erstaunlich ist auch, wie schon bei der Diskussion der Elektronenspektren beschrieben, der stark bathochrome Schift des Absorptionsmaximums zu einem Doppelmaximum. Als Struktur dieser Verbindung kann im Gegensatz zu der einfach protonierten Form eine viel stärkere Delokalisierung der Doppelbindungen angenommen werden, als dies bei der einfach protonierten Form der Fall ist. Die Strukturen sind schon bei der Diskussion der Elektronenspektren angegeben.

 

Dass die Protonierung der in 7-Stellung substituierten Xanthopterine in 8-Stellung nicht nur den angegebenen Chromophor des Systems ändert, sondern noch weiter in die Struktur des Moleküls eingreift, zeigen sich anhand der NMR Spektren. So sind die 2 Aminoprotonen des Erythropterins [10] und des 7-Acetonylxanthopterins [133] in TFS nicht zu sehen, während sie für die in 7-Stellung durch Alkyl, Carboxyl und Alken substituierten Xanthopterinderivate als relativ scharfe Singulette (Dn = 10 Hz) im Bereich von 7,6 ppm - 8,2 ppm erscheinen. In Figur 44 sind zum Vergleich die NMR Spektren von Erythropterin [10] und Lepidopterin [11] in TFS angegeben.

 

 

Im Erythropterin [10] erscheint in TFS das Vinylproton bei 7,44 ppm als einziges Signal, bei Lepidopterin [11] erscheint das Vinylproton bei 7,01 ppm. Daneben sind noch bei 7,90 ppm das Signal der C(2)-Aminogruppe und die drei Signale, die einem Ammoniumkation entsprechen, im Verhältnis 1:1 zu beobachten.

Diese drei Signale waren selbst beim sorgfältigst gereinigten Lepidopterin [11] vorhanden. Es kann angenommen werden, dass das Ammoniumsalz gebildet worden ist, oder dass die in Figur 36 angegebene Struktur vorliegt.

 

 

 

3.4.3. Diskussion der chemischen Abbauprodukte.

 

3.4.3.1. Verbrennungsanalyse

 

Die gefundenen C-, H- und N-Werte zeigen als auffallendes Merkmal einen sehr geringen Anteil an Stickstoff von ca. 17%, wenn man die Produkte mit den anderen Pterinen vergleicht. In Tabelle 14 sind die Elementaranalysen einiger Pterinpigmente aufgeführt

 

Tabelle 14

 

 

Auf Grund der CHN-Analyse und unter der Annahme, dass der Molekularpeak bei ungefähr 385 u liegt, kann für das Platynerepterin eine mit einer grossen Unsicherheit behaftete Summenformel von

 

C₁₄H₁₇N₅O₈

 

angegeben werden. Für diese Formel würden die Prozentwerte so aussehen;

 

 

3.4.3.2. Oxidation in saurer Lösung an Luft

 

Das Leukopterin [4], welches aus Platynerepterin gebildet wurde, zeigte eindeutig die Zugehörigkeit dieses Naturproduktes zu der Klasse der Pterine. Leukopterin [4] als Abbauprodukt der farbigen Pterine wird sehr häufig gefunden. Es ist ein sehr beständiges Produkt welches sehr leicht aus einer grossen Anzahl von Pterinen als Oxidationsprodukt gebildet wird. So wird aus Xanthopterin [6] mit H₂O₂, PtO₂ und O_2, oder mit Periodsäure, das Leukopterin [4] gebildet (119).

   Aus Erythropterin [10] entsteht mit Perhydrol in Schwefelsäure die Xanthopterin-7-carbonsäure [41] und daneben das Leukopterin [4] (108).

Das Pterorhodin [12] selbst bildet in schwefelsaurer Lösung ebenfalls Leukopterin [4] als Abbauprodukt.

Auch aus 7-Methylxanthopterin [8] bildet sich als Abbauprodukt das Leukopterin [4]. Die Bildung kann man sich nach folgendem Schema vorstellen: Wenn 7-Methylxanthopterin [8] in 2 M Schwefelsäure unter Durchleiten von Luft erwärmt wird, bildet sich Pterorhodin [12]. Durch Disproportionierung von Pterorhodin [12] können sich das 7-Methylxanthopterin [8] und das Leukopterin [4] bilden.

Die Bildung des Pterorhodins [12] aus 7-Methylxanthopterin [8] war Gegenstand einiger Untersuchungen in unserem Labor.

Vermutlich wird das 7-Methylxanthopterin [8] durch Luftsauerstoff zu der Xanhthopterin-7-carbonsäure [41] oxidiert, welche dann zum Xanthopterin [6] decarboxylieren kann. Durch oxidative Kupplung, welche vermutlich über Radikale verläuft, kann das Pterorhodin [12] gebildet werden, welches dann, wie schon beschrieben, weiter zu Leukopterin [4] oxidiert werden kann.

Aus Erythropterin [10] bildete sich in sauren Lösungen immer das Pterorhodin [12] (120) (121). Die Bildung kann man sich so vorstellen, dass durch Oxidation das 7-Acetylxanthopterin entsteht, welche sehr schnell zu 7-Methylxanthopterin [8] decarboxyliert wird. Die weiteren Abbaureaktionen sind bei 7-Methylxanthopterin [8] beschrieben.

Gleiches Verhalten wurde bei der Kondensation von Xanthopterin [6] mit 7-Acetonylxanthopterin [133] gefunden. Als Produkt konnte das Pterorhodin [12] gefunden werden. In der nachfolgenden Figur 45 sind die untersuchten und möglichen Wege zur Leukopterinbildung auf gezeichnet.

 

 

Die Schritte von der Xanthopterin-7-carbonsäure [41] zum Leukopterin [4] sind nicht beschrieben. Ein Ansatz zur Erklärung dieser Reaktionen hierzu ist der, dass wir gefunden haben, dass Xanthopterin-7-carbonsäure [41] in Ammoniak zu 7-Aminoxanthopterin [42] oxidiert werden kann (beschrieben bei den Abbauprodukten von Platynerepterin).

 

Die Beschreibung des Leukopterins [4] als Abbauprodukt bei den 6-substituierten natürlichen farbigen Pigmenten ist nicht speziell beschrieben, da es im Bezug auf die Strukturaufklärung wenig informativ ist. Es kann aber angenommen werden, dass es ebenfalls gefunden werden kann, da als Abbauprodukte der 6- substituierten farbigen Pterine das Xanthopterin [6] gefunden wurde, welches leicht zu Leukopterin [4] oxidiert werden kann. So wurde als Abbauprodukt des Sepiapterins [13] in Borax das 7,8-Dihydroxanthopterin [21] isoliert (103), welches leicht zum Xanthopterin [6] oxidiert.

 

3.4.3.3. Verhalten in basischem Milieu und unter Lichteinfluss

 

Wenn Nerepterin und Platynerepterin in basischem Milieu, d.h. in 0,1 M – 1,0 M Natronlauge aufbewahrt wurden, konnte keine Veränderung der Produkte im UV-Sichtbarspektrum festgestellt werden. Sobald jedoch die Lösungen an Licht stehengelassen wurden, verschwand die Farbe der Lösungen und es blieb eine gelbliche Lösung mit blauvioletter Fluoreszenz zurück. Die Zersetzung an Licht ist für Pterine, die eine Seitenkette in 6 Stellung besitzen sehr typisch. So wird Sepiapterin [13] und Deoxysepiapterin [14] an Licht leicht zu Pterin [6] und Pterin-6-carbonsäure abgebaut (123).

Die Zersetzung durch Licht ist auch bei dem in N-8-Stellung mit einer Polyhydroxykette substituierten Lumazin [3], dem Riboflavin [49] typisch. So entsteht in saurem Milieu das Lumichrom [50], in basischem Milieu das Lumiflavin [51] (124)(125).

 

 

3.4.3.4. Oxidation mit Kaliumpermanganat

 

Dass durch Kaliumpermanganatoxidation von Nerepterin und Platynerepterin identische Abbauprodukte erhalten werden konnten, zeigt, neben den sehr verwandten NMR-Spektren der Produkte, dass sie sich verwandt sein müssen. Man kann somit annehmen, dass das Nerepterin in seiner Grundstruktur dem Platynerepterin recht ähnlich ist.

 

3.4.3.5. Ozonolyse

(nicht diskutiert)

 

 

3.4.3.6. Reduktion mit Natriumborhydrid

Die Reduktion mit Natriumborhydrid wurde z.B. bei der Reduktion des Erythropterins [10] zu dem Ekapterin [9] angewandt. Dass Platynerepterin mit Borhydrid leicht reduziert werden konnte, könnte auf das Vorliegen einer Carbonylgruppe, wie bei Erythropterin [10], hinweisen. Erstaunlich hingegen ist, dass das gebildete Produkt nicht wie ein Alkohol relativ stabil gegenüber Oxidation ist, sondern durch Luft sehr leicht wieder zum Ausgangsprodukt oxidiert wird.

Dieses Verhalten von Platynerepterin ist eher den 6-substituierten 7,8-Dihydropterinen eigen. So lassen sich Sepiapterin [13], die Drosopterine [13], [14], [15] und das in Bombyx mori gefundene 8-Methylsepiapterin [19] leicht reduzieren. Die Rückoxidationen dieser reduzierten Produkte führen jedoch nicht mehr zu den Ausgangsstoffen.

 

3.5. Strukturvorschläge

 

Die bisher erhaltene Information über die Naturprodukte erlaubt keine genauere Strukturbeschreibung.

So konnte bisher nicht entschieden werden, ob die Pigmente zu der 7-substituierten Xanthopteringruppe oder zu der Gruppe der 6-substituierten 7,8-Dihydropterine gehört. Diese Unsicherheit erschwerte und erschwert immer noch das Vorgehen in der Aufklärung der Struktur. Im Folgenden sind „trotz allem“ einige Vorschläge gemacht worden.

 

Typ 7-substituierte Xanthopterinderivate

 

Für das Nerepterin wurde ein pH_i von 2,8 ermittelt. Im Vergleich zu anderen Pterinen (Drosopterine 10,8, Sepiapterin 9,4, Erythropterin 1,0 (126)) zeigt sich, dass in dieser Verbindung die stark sauren Eigenschaften vorherrschen. Man könnte annehmen, dass es sich wie beim Erythropterin [10] um eine Säure handeln könnte. Das Vorliegen einer polyhydroxylierten Seitenkette zeigte sich durch die Periodatspaltung, die ein Produkt mit unverändertem Chromophor bildete. Ein weiterer Hinweis auf eine solche Seitenkette zeigt sich in der Lichtempfindlichkeit des Produktes (ähnlich dem Riboflavin [49]). Der Chromophor des Produktes lässt sich erklären anhand des Elektronenspektrums der protonierten Form z.B. des Erythropterins [10]. Im Nerepterin könnte diese Struktur fixiert sein, durch eine Substitution mit einer polyhydroxylierten Seitenkette in der 8-Stellung, was dieselben Folgen wie eine Protonierung an dieser Stelle haben dürfte. Als Vorschlag soll diese angegebene Struktur gelten.

 

 

Mit dieser Struktur im Einklang, respektive nicht im Widerspruch sind die NMR-Spektren unter der Annahme, dass das Signal bei 1,46 ppm einer nicht mehr entfernbarer CH₃-Gruppierung des Ethanols entspricht, der zum Waschen des Produktes verwandt wurde. Die Signale zwischen 3,01 und 4,49 ppm würden den H-Atomen der polyhydroxylierten Kette entsprechen (für Riboflavin [49] 4,1-5,5 ppm).

Das Signal bei 8,26 ppm würde mit dem Vinylproton in der C(7)-Seitenkette übereinstimmen.

Mit der angegebenen Formel ebenfalls in Übereinstimmung ist die CHN-Analyse. Für die angegebene Formel C₁₄H₁₇N₅O₉ würden die Werte (berechnet C 42,11%, H 4,29%, N 17,53%) nicht in allzu scharfem Widerspruch liegen. Für das Platynerepterin müsste eine ähnliche, eventuell eine Dimere Formulierung in Betracht gezogen werden. Möglich wäre auch eine Lactonbildung der COOH-Gruppe mit einer OH-Gruppe der hydroxylierten Seitenkette, was seinen Niederschlag im MS-Spektrum finden würde (MS: M⁺ = 381 u; gefunden: 381 u-385 u).

 

Typ 6-substituierte 7,8-Dihydropterine

Bei der Annahme, dass die Pigmente der Gruppe der 6 subst. 7,8-Dihydropterine zuzuordnen sind, könnten folgende Argumente dienen: Die Fluoreszenz des Nerepterins ist gleich wie diejenige des Deoxysepiapterins. Ein weiteres Indiz wäre die Photolabilität der Produkte. Ein Vorschlag könnte dieser sein:

 

 

 

Dazu würde das NMR-Spektrum die CH₃-CHOH-Gruppierung stützen. Das Signal bei 4,49 ppm beim Platynerepterin, resp. Bei 4,28 ppm bei Nerepterin, würde den zwei C(7)-H-Atomen entsprechen.

Die Verhältnisse im Bezug auf den Chromophor von solchen Systemen sind noch wenig untersucht und lassen nicht einmal Raum zu Spekulationen.

 

 

Literaturverzeichnis zu eigenen Arbeiten

(102)   Fage und R Legendre, Archives de Zoologie experimentale et general 67, 23 (1927)

(103)   S. Nawa, Bull.Chem.Soc. Japan 33, 1553 (1960)

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(107)   G. Scheibe in “Optische Anregung organischer Systeme”, Seite 111, 2. Int. Farbensymposium, Verlag Chemie, (1966)

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(126)   W. Pfleiderer, Chem. Ber., 2195, (1962)

 

 

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