Isolierung und Untersuchung der Pigmente in den Augen des Polychäten Platynereis dumerilii

 

Experimenteller Teil

Inhaltsverzeichnis zum Experimentellen Teil

 

 

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 4. Experimenteller Teil

4.1 Allgemeines

 

Elektronenspektren wurden am BECKMANN ACTA III und UNICAM SP 500, IR-Spektren am PERKIN ELMER Spektrographen (Modell 275 mit Gitteroptik) aufgenommen. Die ¹H-NMR-Spektren wurden am Varian 60, am Varian XL-100-Spektrometer mit Tetramethylsilan (TMS) als internem Standard aufgenommen. Bei Fluorsulfonsäure als Lösungsmittel wurde TMS in einer Glaskapillare als externer Standard zugegeben.

Reemissionsspektren ab Dünnschicht wurden an einem Dünnschichtspektralphotometer ZEISS PMQ II aufgenommen.

 

Für die Säulenchromatographie verwendeten wir Whatmann-Cellulosepulver, Sephadex G-25 fine und Sephadex LH 20 der Firma PHARMAZIA Uppsala.

 

Zur Papierchromatographie diente Whatmann Nr.1 und SCHLEICHER und SCHÜLL 2668. Zur Dünnschichtchromatographie wurden Cellulosefertigplatten mit und ohne Fluoreszenzindikator der Firma MERCK verwendet. Auswertung der Chromatogramme erfolgte unter UV-Licht. Um die Fluoreszenz zu verstärken wurden die Chromatogramme manchmal mit flüssigem Stickstoff gekühlt.

Als Laufmittel wurden vorwiegend folgende Systeme verwendet:

 

 

 

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4.2. Beschaffung und Aufarbeitung der Augenpigmente von Platynereis dumerilii

Für die Arbeit wurden Tiere aus zwei verschiedenen Exkursionen verwendet und auch verschieden aufgearbeitet.

Erste Aufarbeitung

15’000 Nereiden, die im Jahre 1970 in Banyuls-s-Mer gesammelt worden waren und  sich aus Platynereis dumerilii, Nereis rava und Nereis zonata zusammensetzten, wurden für die Isolierung der Pigmente verwendet. Die in Kunzmann Alkohol aufbewahrten Tiere wurden im Juli 1971 geköpft. Die Köpfe wurden homogenisiert, mit gewaschener Cellulose versetzt und eingeengt. Das Produkt wurde auf eine trocken gestopfte, mit Wasser klimatisierte Cellulosesäule gegeben (100 g, Höhe 22 cm, Durchmesser 4 cm). Nach Eluieren mit Wasser wurde das Elutionsmittel langsam mit Salzsäure/Essigsäure verstärkt. So konnte zuerst das gelbgrün fluoreszierende Nerepterin und anschliessend das orange fluoreszierende Platynerepterin roh erhalten werden. Die Eluate wurden eingeengt. Das rohe Platynerepterin wurde erneut auf eine Cellulosesäule (Höhe 12 cm, Durchmesser 1,3 cm) aufgetragen und zuerst mit Wasser dann zunehmend mit Ameisensäure eluiert, bis zu einem Verhältnis Wasser/Ameisensäure 1:1. Das noch vorhandene schnell laufende Nerepterin wurde zur Hauptmenge des Nerepterins gegeben. Das eluierte Platynerepterin wurde zur Trockene eingeengt. Die Ausbeute an rohem Produkt betrug 464 mg. Das Produkt wurde in 0,1 % Ammoniak gelöst und auf eine Anionentauschsäule Dowex 1 x 8 (Höhe 3 cm, Durchmesser 4 cm) gegeben und mit Wasser eluiert. Darauf wurde mit 30% Ameisensäure eluiert und das Eluat im Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Die Ausbeute betrug 29 mg.

Zur weiteren Reinigung des Platynerepterin wurde das Produkt in einigen Millilitern Ameisensäure gelöst und durch Verdünnen mit Wasser ausgefällt. Nach Abzentrifugieren und 3-maligem Waschen mit Wasser und Kunzmannalkohol wurden 4,4 mg reines Platynerepterin erhalten.

Das rohe Nerepterin wurde auf eine mit Whatmanncellulose nass gefüllte Säule (Höhe 20 cm, Durchmesser 4 cm) gegeben und mit Wasser bidest. eluiert. Nach Einengen der eluierten Nerepterinfraktion wurden 320 mg rohes Nerepterin erhalten. Das Produkt wurde in Ameisensäure gelöst und auf 12 Blätter Schleicher und Schüll 2668 Papier aufgetragen. Mit 3% Ammoniumchlorid wurde auf einer Strecke von 54 cm eluiert. Die Eluate mit der reinen Fraktion an Nerepterin wurden auf eine Säule (Höhe 10 cm, Durchmesser 1,3 cm) mit Kationentauscher Dowex W50 in der H⁺-Form gegeben. Zuerst wurde mit Wasser gewaschen, anschliessend mittels 1% Ammoniak eluiert und eingeengt. Die Ausbeute betrug 14 mg. Nach Auflösen des Produktes in Ameisensäure und Ausfällen durch verdünnen mit Ethanol konnten 3,5 mg reines Nerepterin erhalten werden.

 

Zweite Aufarbeitung

Auf einer Exkursion im Sommer 1975 in Banyuls-s-Mer wurden 24450 Platynereis dumerilii, Nereis rava und Nereis zonata gefangen. Die Tiere wurden nach Aufbewahrung in Ethanol dekapitiert und die Köpfe in einem Volumen von 200 mL Ethanol homogenisiert. Im Rotationsverdampfer wurde der Alkohol abgezogen und der Rückstand mit 200 mL Ameisensäure versetzt. In die Aufschlämmung wurde 50 Gramm Cellulosepulver eingerührt und alles auf eine breite Cellulosesäule (Höhe 5 cm, Durchmesser 12 cm) gegeben und mit reiner Ameisensäure eluiert. Die gesamte orangefarbige Fraktion wurde auf ungefähr 50 mL Volumen eingeengt und auf eine Cellulosesäule (Höhe 35 cm, Durchmesser 4 cm) gegeben. Um ein Verstopfen der Säule zu verhindern wurde die Lösung in den Kopf der Säule eingerührt und mit einer Schicht von 1 cm Cellusosepulver überschichtet. Eluiert wurde mit 10% Ameisensäure.

Es wurde auf diese Weise eine gelbe Fraktion mit dem Nerepterin eluiert, während die violette Fraktion im oberen Teil der Säule zurückblieb. Das violette Produkt mit dem Platynerepterin wurde anschliessend mit 50%iger Ameisensäure eluiert und zur Trockene eingeengt. Dieses Produkt wurde nach dreimaligem Auflösen in Ameisensäure und Ausfällen mit Wasser, abfiltriert und am Hochvakuum getrocknet. Auf diese Weise wurden 13 mg reines Platynerepterin erhalten.

Die gelbe Fraktion die das Nerepterin enthielt, wurde auf 50 mL eingeengt und auf eine Sephadexsäule LH 20 gegeben. Durch Eluieren mit Wasser wurde zuerst ein schnell laufendes braunes Produkt eluiert, welches verworfen wurde. Nach längerem Eluieren mit bidest. Wasser konnte das Nerepterin als reine Fraktion erhalten werden. Durch Einengen der Lösung auf ein Volumen von ungefähr 100 mL konnte das reine Nerepterin ausgefällt werden. Die Ausbeute betrug nach Trocknen im Hochvakuum 8 mg.

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 4.3. Charakterisierung von Nerepterin und Platynerepterin

4.3.1. Nerepterin

 

 

  

  

  

 

 

4.3.1.1. Nerepterin in basischem Milieu unter Lichteinfluss:

 

Eine Lösung von 0,12 mg Nerepterin in 10 mL 0,1 M Natronlauge wurde zum Teil im Dunkeln, zum anderen Teil an Licht aufbewahrt. Im Verlaufe der Zeit wurde die Extinktion des längstwelligen Maximums gemessen.

 

 

4.3.1.2. Oxidation von Nerepterin mit Kaliumpermanganat

 

Ca. 0.05 mg Nerepterin wurden in einem Analysenröhrchen mit: 1 Tropfen 0,1 M Natronlauge gelöst und aus einer Kapillare mit sehr verdünnter Kaliumpermanganatlösung versetzt, welches sofort reduziert wurde. Dünnschichtchromatographisch wurde ein blauviolett fluoreszierendes Abbauprodukt charakterisiert.

 

 

4.3.2. Platynerepterin
 

  

  

  

  

  

 

4.3.2.1. Oxidation von Platynerepterin in saurem Milieu an Luft

 

0,77 mg reines Platynerepterin wurde in 4 mL 50% Ameisensäure gelöst und unter Durchleiten von Luft stehengelassen. Die verdunstete Flüssigkeit wurde fortlaufend ersetzt. Nach 8 Tagen wurde das Produkt in einem 10 cm langen Streifen auf langsam laufendes Chromatographiepapier aufgetragen und mit denn Elutionsmittel 2 eluiert. Nach einer Laufstrecke von 32 cm konnten 5 fluoreszierende Produkte beobachtet werden.

 

 

Das weissblau fluoreszierende Abbauprodukt mit dem Rf = 0,07 wurde mit 1% Ammoniak eluiert,  zur Trockene eingeengt und für die weiteren Untersuchungen verwendet.

 

Charakterisierung des Abbauproduktes:

 

Vergleich des Abbauproduktes (Rf in 2 = 0,07) mit Leukopterin [4] .

 

 

* Elutionsmittel: Pyridin / Essigester / Wasser 4:3:3

  

  

 

4.3.2.2. Platynerepterin in basischem Milieu und unter Lichteinfluss

 

Eine Lösung von Platynerepterin mit einer Konzentration von 0,145 mg/10 mL wurde zum Teil im Dunkeln, zum anderen Teil am Tageslicht stehengelassen. Im Verlaufe der Zeit wurde die Extinktion des längstwelligen Maximums gemessen.

  

 

Zur Identifizierung der Abbauprodukte wurde 0,20 mg Platynerepterin in 2 Tropfen Wasser und 0,3 mL Natronlauge gegeben. Während 5 Stunden wurde die Lösung im Wasserbad auf 90° C erwärmt. Darauf wurde das Reaktionsprodukt auf eine präparative Celluloseplatte aufgetragen und 2-mal mit 2% Ammoniak eluiert. Die Platte, auf der zu Vergleichszwecken Leukopterin [4] und 7-Xanthopterincarbonsäure [41] aufgetragen worden war, zeigte folgendes Bild:

 

 

Das gelb fluoreszierende Abbauprodukt des Platynerepterins wurde abgekratzt, 2-mal mit je 2,5 mL 10% Ammoniak eluiert und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in einem Tropfen Ameisensäure gelöst und für Dünnschichtchromatogramme verwendet.

 

 

Mischchromatogramme des Abbauproduktes mit 7-Xanthopterincarbonsäure [41] erschienen als einheitliche Flecken.

 

4.3.2.3. Oxidation von Platynerepterin mit Kaliumpermanganat

 

0,12 mg Platynerepterin wurden in einem Analysenröhrchen mit 2 Tropfen 0,1 M Natronlauge gelöst, und mit einem Unterschuss von verdünnter Kaliumpermanganat versetzt. Dünnschichtchromatogramme des Reaktionsproduktes zeigten ein Gemisch von 8 fluoreszierenden Verbindungen.

  

 

*Die Zuordnung der blau fluoreszierenden Produkte ist nicht eindeutig.

 

Wurde die Lösung des Platynerepterins in 0.1 M Natronlauge mit einem geringen Überschuss an Kaliumpermanganatlösung versetzt, so konnte nur noch ein blau violett fluoreszierendes Produkt in sehr geringer Menge dünnschichtchromatographisch festgestellt werden.

 

 

Dieses Produkt ist identisch mit dem unter 4.3.1.2. beschriebenen, blau fluoreszierenden Abbauprodukt des mit Kaliumpermanganat oxidierten Nerepterins.

 

4.3.2.4. Oxidation des Platynerepterins mit Ozon

 

0.10 mg Platynerepterin wurden in 6 mL Ameisensäure gelöst und mit Ozon / Luftgemisch durchspült. Nach Zugabe von einem grossen Überschuss (14 mg) von Ozon, änderte sich die Farbe der Lösung zu gelb. Die Lösung wurde auf 0,5 mL eingeengt und mit 0,2 M Natriumcarbonatlösung auf pH = 3 gebracht. Das .Reaktionsgemisch wurde auf eine präparative Celluloseplatte aufgetragen und mit Wasser entwickelt. Es konnten 2 Produkte gesehen werden. Ein schnell laufendes blau fluoreszierendes Produkt und ein am Start verbleibendes gelb fluoreszierendes Produkt.

a) Das gelb fluoreszierende Produkt wurde durch Zerschneiden der Glasplatte vom blau fluoreszierenden Produkt getrennt. Zuerst wurde mit Wasser eluiert. Um das Produkt zu isolieren wurde mit 1 % Ammoniak eluiert. Nach dem Einengen wurde das Produkt charakterisiert.

 

  

 

b) Das blau fluoreszierende Abbauprodukt wurde von der Platte mit Wasser eluiert und charakterisiert.

 

  

 

4.3.2.5. Reduktion von Platynerepterin mit Natriumborhydrid

 

In einer UV-Küvette wurde Platynerepterin in 10% Ammoniak gelöst und mit Stickstoff gespült. Zu dieser Lösung wurde ca.5 mg Natriumborhydrid gegeben und der Reaktionsverlauf durch Aufnahme der Elektronenspektren verfolgt (siehe Figur 28). Nach 5 Stunden wurde eine weitere Spatelspitze Natriumborhydrid zugegeben, da die Reaktion nicht weiterlief. Nach 7 Stunden war das Platynerepterin zu einem neuen Produkt reduziert. Isosbestische Punkte konnten bei 234 nm, 285 nm, 343 nm, 393 nm und 450 nm gemessen werden.

 

 

Das reduzierte Produkt wurde in der Küvette mit Salzsäure versetzt. Nach 7 Stunden stehen lassen an der Luft, war alles Produkt wieder in Platynerepterin zurückoxidiert worden. Durch Aufnahme von Elektronenspektren und Rf-Werten wurde die Rückoxidation zum Platynerepterin überprüft.

 

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 4.4. Synthesen der Pterine und der Modellverbindungen
 

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4.4.1. Oxidatives Kondensationsprodukt [122] von 2-Methylchinoxazolon[120] und Chinoxazolon [121]

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In einem qualitativen Versuch wurden je 50 mg der Ausgangsstoffe 2-Methylchinoxazolon und Chinoxazolon in 10 mL DMSO gelöst und ein Tropfen Schwefelsäure zugegeben. Nach einigen Stunden erwärmen auf 120° C färbte sich die Reaktionslösung dunkel.

Das gesamte Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadexsäule (LH-20, Höhe 24 cm, Durchmesser 5,5 cm) gegeben und mit Wasser eluiert. Ein gelbes Produkt wurde eluiert und eingeengt. Für ein Elektronenspektrum wurde etwas Produkt in verdünnter Ameisensäure gelöst. Bei Zugabe von konz. Ameisensäure färbte sich die Lösung rot und bei weiterer Zugabe von Schwefelsäure färbte sie sich intensiv violett. Die Farbänderungen waren durch Zugabe von Wasser wieder rückgängig zu machen (Figur 32).

 

4.4.2. Oxidatives Kondensationsprodukt [124] von Xanthopterin [6] und 2-Methylchinoxazolon [124]

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Bedingungen für die Synthese dieses Kondensationsproduktes [124] fehlen.

  

 

4.4.3. Pterorhodin [12]

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Pterorhodin [12] wurde nach der Vorschrift von Russel et alt. (201) synthetisiert.

 

  

 

Das Elektronenspektrum von Pterorhodin [12] in 0,1 M Natronlauge veränderte sich schnell. In Intervallen von 2 Minuten wurden Spektren aufgenommen (Figur 34). Der isosbestische Punkt liegt bei 463 nm. Das l_Max des neu gebildeten Produktes liegt bei 415 nm.

 

4.4.4. Xanthopterin [6]

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Xanthopterin [6] wurde nach einer Vorschrift von A. Albert und H. C. S. Wood (202) synthetisiert, welche durch Reduktion des Leukopterins [4] mit Natrium-Quecksilber das Dihydroxanthopterin [21] erhielten. Nach Oxidation mit Kaliumpermanganat wurde das Xanthopterin [6] erhalten.

Wir reinigten das Xanthopterin [6] über das Hydrochlorid, welches in kristalliner Form erhalten wurde. Durch Röntgenstrukturanalyse wurde von uns (203) die Struktur von diesem Xanthopterin-Hydrochlorid bestimmt.

 

  

 

4.4.5. 7-Methylxanthopterin [8]

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Nach einer Vorschrift von Gertrude B. Elion und G. H. Hitchings (204) wurde das 7-Methylxanthopterin [8] hergestellt. Das rohe 7-Methylxanthopterin [8] wurde nicht wie in der Vorschrift aus 2 M Salzsäure umkristallisiert, da dabei grössere Mengen von Pterorhodin [12] die gewünschte Reinigung zunichte machten, sondern das 7-Methylxanthopterin [8] wurde in Ameisensäure bei 90° C gelöst und mit einem grossen Überschuss von siedendem Wässer versetzt und langsam abgekühlt. Die Verunreinigungen wie sie bei der anderen Methode auftraten (6-Methylisoxanthopterin und Pterorhodin [12]) waren nicht mehr auffindbar.

 

  

  

  

 

 

4.4.6. 7-Ethylxanthopterin

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In 200 mL 2 M Schwefelsäure wurden 10 Gramm 2,4,5-Triamino-6-hydroxypyrimidin (THP) und 5 Gramm 2-Oxobuttersäure gekocht. Es wurde während 3 Stunden gekocht. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und die Lösung über Nacht stehengelassen. Es fielen einige hellgelbe Kristalle aus, die ebenfalls abfiltriert wurden. Bei Siedehitze wurde anschliessend mit Natriumcarbonat auf pH = 4 gebracht. Über Nacht wurde erneut stehengelassen und der gebildete Niederschlag abgenutscht. Nach Waschen des Niederschlages mit Wasser/Ethanol und Ether wurde im Hochvakuum bei 80° C während 4 Stunden getrocknet. Die Ausbeute betrug 5,0 g.

 

  

  

 

 

4.4.7. 7-Propylxanthopterin

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2, 5 g THP-Sulphat und 1,5 g 2-Oxovaleriansäure (Fluka) wurden in 200 mL 2 M Schwefelsäure eine Stunde gekocht. Nach Abkühlen auf 40° C wurde abfiltriert und über Nacht stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und in 10 mL konzentriertem Ammoniak gelöst. Das Ungelöste wurde abfiltriert. Nach dem Abziehen des Ammoniaks am Vakuum wurde das Produkt auf eine Sephadexsäule (LH 20, Höhe 20 cm, Durchmesser 5,5 cm) gegeben und mit 1% Ammoniak eluiert. Neben blau fluoreszierenden Produkten wurde das blaugrün fluoreszierende Propylxanthopterin eluiert. Die Fraktion wurde leicht eingeengt (um den Ammoniak zu entfernen) und mit einigen Tropfen Ameisensäure leicht angesäuert. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und nach Waschen mit Alkohol und Ether im Hochvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 213 mg und war chromatographisch einheitlich.

  

  

  

  

  

 

 

4.4.8. 7-Isopropylxanthopterin

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1 g des Natriumsalzes von 3-Methyl-2-oxo-buttersäure (Fluka puriss.) wurde mit 2,1 g THP-Sulphat in 100 mL 1 M Schwefelsäure während 4 Stunden gekocht. Die Lösung färbte sich leicht gelblich. Mit Natriumhydrogenkarbonat wurde neutralisiert. Über Nacht fiel ein weiss-gelbliches Produkt aus, welches abfiltriert wurde. Es erwies sich als das 7-Isopropylisoxanthopterin. Die Reaktionslösung wurde auf 50 mL eingeengt und auf einer Sephadexsäule (LH 20, Höhe 28 cm,  Durchmesser 6,5 cm) mit Wasser chromatographiert. Eine schnell laufende xanthopterinfarbig fluoreszierende Fraktion wurde im Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt, in wenig konz. Ammoniak gelöst und erneut auf dieselbe Sephadexsäule aufgetragen. Die wiederum mit Wasser eluierte Fraktion wurde aufgenommen und etwas eingeengt. Nach Zugabe von einigen Tropfes Ameisensäure fiel ein hellgelbes Produkt aus. Es wurde mit Ethanol und Ether gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 59 mg.

  

  

  

 

 

4.4.9. 7-Acetonylxanthopterin

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Dieses Produkt wurde nach der Vorschrift von R. Tschesche und F. Horte (205) durch Kondensation von THP-Sulphat mit Acetonoxalester in 2 M Schwefelsäure synthetisiert.

 

  

  

  

 

 

4.4.10. 7-(2’-Hydroxypropyl)-xanthopterin

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205 mg 7-Acetonylxanthopterin [133] wurden in 100 mL 0,05 M Natronlauge gelöst. Nach Spatelspitzenweiser Zugabe von Natriumborhydrid während 5 Stunden war alles Ausgangsprodukt reduziert zu einem Produkt mit derselben Fluoreszenz wie das Xanthopterin [6]. Mit 5 mL Aceton wurde der Überschuss an Natriumborhydrid unter Kühlen mit flüssigem Stickstoff vernichtet. Mit Ameisensäure wurde auf pH 4,0 eingestellt, und der gelbe Niederschlag abzentrifugiert. In wenig konz. Ammoniak wurde das Produkt gelöst und über eine Sephadexsäule (100 g LH 20, h = 28 cm, D = 6,5 cm) chromatographiert. Als Elutionsmittel wurde 1% Ammoniak verwendet.

Die xanthopterinfarbig fluoreszierende Fraktion wurde eingeengt, bis alles Ammoniak entfernt war. Nach Zugabe von einigen Tropfen Ameisensäure bis pH 6 fiel ein gelbes Produkt aus. Nach Abzentrifugieren und Waschen mit Ethanol und Ether wurde im Hochvakuum Stunden bei 80° C getrocknet. Die Ausbeute an 7-(2’-Hydroxypropyl)-xanthopterin betrug 45 mg.

  

  

  

  

 

 

4.4.11. 7- Propyl-(2’)-en-xanthopterin

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50 mg 7-(2’-Hydroxypropyl)-xanthopterin wurde in 100 mL wasserfreier Ameisensäure 1 Stunde auf 80° C erwärmt. Das Reaktionsprodukt färbte sich dunkel. Das Produkt wurde zur Trockene eingeengt und in wenig 1 M Natronlauge auf eine Sephadexsäule (LH 20, Höhe 28 cm, Durchmesser  cm) aufgetragen und mit 1% Ammoniak eluiert. Nach Einengen, bis der Ammoniak entfernt war und Zugabe von einigen Tropfen Ameisensäure, fiel ein gelbes Produkt aus, welches mit Ethanol und Ether gewaschen wurde. Getrocknet wurde das Produkt im Hochvakuum. Die Ausbeute betrug 30 mg.

  

 

 

  

  

 4.4.12. Dehydroekapterin

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150 mg 7-Methylxanthopterin [8] wurden mit einem Überschuss von 2 g Glyoxylsäure in 70 mL konz. Salzsäure bei 80° C gelöst und 5 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Aus der ursprünglich klaren Lösung fiel ein gelbbrauner Niederschlag aus. Nach Abkühlen wurde abfiltriert und mit Wasser, Ethanol und Ether gewaschen. Im Hochvacuum wurde getrocknet. Auf diese Weise wurden 130 mg Dehydroekapterin erhalten.

 

 

  

  

 

 

4.4.13. Ekapterin

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Als alternative Ekapterinsynthese zu der von Viscontini und Stierlin entwickelten Synthese (209) erwies sich eine Modifikation der Dehydroekapterinsynthese. Analog einer Vorschrift von M. Debono, R. M. Malloy und L. E. Patterson (206), die durch Kondensation von Glyoxylsäure an 5-a-Androstanolon eine a-Hydroxyessigsäure erhielten, wurde auch das Ekapterin [9] durch Kondensation von Glyoxylsäure mit 7-Methylxanthopterin [8] erhalten.

100 mg 7-Methylxanthopterin [8] wurden in 50 mL Ameisensäure gelöst und bei 50° C 100 mg Glyoxylsäure zugegeben. Nach 5 Minuten wurde die Reaktionslösung im Rotationsverdampfer eingeengt, mit konz. Ammoniak versetzt und auf eine Sephadexsäule (LH-2, Höhe 27 cm, Durchmesser d 5,5 cm) auf getragen und mit 1% Ammoniak eluiert. Die Ekapterinfraktion wurde eingeengt, bis das Produkt ausfiel. Durch Zugabe von Aceton konnte weiteres Produkt ausgefällt werden. Nach Abzentrifugieren und Waschen mit Ethanol und Ether wurde in Hochvacuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 10 mg, im Dünnschichtchromatogramm einheitliches und mit authentischem Ekapterin [9] identisches Produkt.

  

 

 

4.4.14. 7-Styrylxanthopterin

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250 mg 7-Methylxanthopterin [8] wurden in 20 mL Ameisensäure bei 80° C gelöst. Dazu wurde ein Ueberschuss von 2 mL Benzaldehyd gegeben. Es wurde auf 100° C während 2 Stunden erwärmt. Im Verlaufe dieser Zeit wurde alles Ausgangsprodukt in ein Produkt mit intensiver gelber Fluoreszenz umgewandelt. Bei 60° C wurde in Rotationsverdampfer eingeengt, in wenig Natronlauge gelöst und auf eine Sephadexsäule (LH 20, Höhe 27 cm, Durchmesser 5.5 cm) aufgetragen. Mit 1% Ammoniak wurde eluiert. Einige fluoreszierende Produkte wurden schnell eluiert, während das Hauptprodukt langsam durch die Säule wanderte. Es wurde im Rotationsverdampfer auf 100 mL eingeengt und mit Ameisensäure auf pH = 3,5 gebracht und stehen gelassen. Ein helloranges Produkt fiel aus, welches abfiltriert wurde und mit Ethanol und Ether gewaschen wurde.

Bei 80° C wurde im Hochvacuum während 5 Stunden getrocknet. Die Ausbeute betrug 348 mg.

 

 

 

  

  

Als Kontrollsynthese wurde das 7-Styrylxanthopterin noch synthetisiert, indem 150 mg 7-Phenacylxanthopterin in 100 mL verd. Natronlauge gelöst wurde und mit 300 mg Natriumborhydrid versetzt wurde. Das überschüssige Natriumborhydrid wurde durch Zugabe von Aceton unter Kühlen mit flüssigem Stickstoff zerstört. Nach Ansäuern mit Ameisensäure fiel Produkt aus, welches abfiltriert wurde und über eine Sephadexsäule (LH-20, Hühe 25 cm, Durchmesser 5,5 cm) mit 1% Ammoniak eluiert wurde. Eine schnell laufende xanthopterinfarbig fluoreszierende Fraktion wurde eingeengt und mit einem Tropfen Ameisensäure angesäuert. Das ausfallende Produkt wurde nach abfiltrieren gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute betrug 26 mg an reduziertem 7-Phenacylxanthopterin.

 

 

50 mg reduziertes 7-Phenacylxanthopterin wurden in ca. 50 mL Ameisensäure kurz gekocht und anschliessend über eine Sephadexsäule chromatographiert. Ein gelb fluoreszierendes Produkt wurde eingeengt, in einem kleinen Volumen Ameisensäure gelöst und mit Wasser verdünnt. Das ausfallende Produkt wurde abzentrifugiert, in Ethanol und Ether gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute betrug 9 mg. Dieses Produkt war identisch (identische IR-Spektren und Rf-Werte) mit dem durch Kondensation von 7-Methylxanthopterin [8] mit Benzaldehyd erhaltenen 7-Styrylxanthopterin.

 

 

4.4.15. 7-Phenacylxanthopterin

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Dieses Produkt wurde von Y. Iwanami und T. Seki (207) synthetisiert, indem sie THP-Sulphat mit dem Ethylester der Benzoylbrenztraubensäure in Essigsäure kondensierten. Durch Umkristallisieren in DMSO erhielten sie orange Kristalle. Weil wir in den Elektronenspektren Unterschiede zu den Spektren von Y. Iwanami und T. Seki (207) erhielten, sind die Werte aus (207) angegeben:

 

 

Wir synthetisierten dieses Produkt durch Kondensation von 340 mg Xanthopterin [6] mit 1 mL Acetophenon in 10 mL DMSO, dem 2 Tropfen konz. Schwefelsäure zugegeben worden war. Nach Erwärmen auf 100° C während einer Stunde hatte sich die Lösung dunkelorange gefärbt.

Nach Abkühlen wurde unter Rühren 50 mL Ether zugegeben und der entstehende Niederschlag abfiltriert und gewaschen mit Wasser, Ethanol und Ether. Im Hochvacuum wurde 4 Stunden bei 0,05 Torr getrocknet. Die Ausbeute betrug 395 mg rohes 7-Phenazylxanthopterin.

Zur weiteren Reinigung wurden 150 mg des rohen Produktes auf einer Sephadexsäule (LH-20, Höhe 28 cm, Durchmesser 6,5 cm), nach Lösen in wenig verdünnter Natronlauge, aufgetragen und mit 1% Ammoniak eluiert. Nach mehreren schnell laufenden, fluoreszierenden Produkten wurde ein langsam laufendes orangefarbenes Produkt eluiert. Diese Fraktion wurde auf dem Rotationsverdampfer eingeengt bis Produkt ausfiel. Mit 2 Tropfen Ameisensäure wurde angesäuert, der Niederschlag abfiltriert und mit Wasser, Ethanol und Ether gewaschen. Über Nacht wurde im Hochvacuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 32 mg.

  

  

  

 

 

4.4.16. 7-Xanthopterincarbonsäure

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Nach Vorschrift von R. Purrmann (208) wurde die Xanthopterincarbonsäure [41] aus 2,4,5-Triamino-6-oxopyrimidinsulphat mit Mesoxalester synthetisiert. Das so erhaltene Produkt enthielt noch das isomere Produkt und wurde mit Wasser als Elutionsmittel über Sephadex chromatographiert.

 

  

  

 

 

4.4.17. Erythropterin [10]

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Erythropterin [10] wurde nach der Vorschrift von M. Viscontini und H. Stierlin (209) synthetisiert.

 

 

  

  

 

 

4.4.18. Lepidopterin [11]

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Dieses Produkt wurde aus Erythropterin [10] durch Behandeln mit Ammoniak nach einer Arbeitsvorschrift von M. Viscontini und H. Stierlin synthetisiert (209). Zur weiteren Reinigung wurde das Lepidopterin [11] über Sephadexsäulen eluiert.

 

 

  

  

 

 

4.4.19. 7-Aminoxanthopterin [42]

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a) 80 mg Xanthopterincarbonsäure [41] wurde in 100 mL konz. Ammoniak während 2 Tagen stehen lassen. Darauf wurde das Produkt im Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt. Das Produkt wurde in 10 mL konz. Ameisensäure gelöst und mit 20 mL Wasser verdünnt. Ein wenig gelbes Produkt (nicht umgesetztes Ausgangsprodukt) wurde dadurch ausgefällt und abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt. Beim Abkühlen einer heissen wässrigen (einige Tropfen konz. Ammoniak wurden zugegeben, damit die Lösung leicht basisch reagierte) Lösung des Filtrats fiel ein cremefarbiges Produkt aus, welches abfiltriert und getrocknet wurde. Die Ausbeute betrug 34 mg.

 

b) 600 mg Xanthopterincarbonsäure [41] wurden in 300 mL konz. Ammoniak gelöst. Unlösliches wurde durch einen Faltenfilter abfiltriert und das Filtrat in einer grösseren Kristallisierschale während 2 Tagen offen stehen gelassen. Nach dem Verdunsten des Ammoniaks fiel ein cremefarbiges Produkt aus welches abfiltriert wurde. Dieses Verfahren wurde 4-mal wiederholt, bis die Ausbeute an 7-Aminoxanthopterin [42] aus den einzelnen Aufarbeitungen ca. 400 mg betrug.

 

Zur Reinigung des rohen 7-Aminoxanthopterins [42] wurde entweder aus heissem Wasser umkristallisiert oder über eine Sephadexsäule gereinigt.

 

Umkristallisieren:

100 mg rohes 7-Aminoxanthopterin [42] wurden in 80 mL siedendem Wasser gelöst, dem beim Abkühlen einige Tropfen konz. Ammoniak zugegeben wurden. Als Produkt wurde nach Abfiltrieren und Trocknen 61 mg 7-Aminoxanthopterin [42] erhalten.

 

Chromatographieren:

140 mg 7-Aminoxanthopterincarbonsäure [42] wurden in möglichst wenig 50% Ammoniak gelöst und auf eine mit 10% Ammoniak klimatisierte Sephadexsäule aufgetragen (LH-20, 200 g, Höhe 25 cm, Durchmesser 8 cm). Das stark blau fluoreszierende Produkt wurde aufgenommen und nach Abziehen des Ammoniaks im Rotationsverdampfer stehengelassen. Der sich bildende Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Die Ausbeute betrug 51 mg.

 

  

  

  

 

 

4.4.20. Xanthopteryl-3-methyl-5,6-dihydro-(1H)-pyrazin-(2)-on [125]

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a) 320 mg Xanthopterin [6] wurde in 20 mL DMSO mit 6 g 3-Methyl-5,6-dihydro-(1H)-pyrazin-(2)-on versetzt. Es wurde auf 140° C erwärmt und während 10 Minuten Luft durch die Lösung geblasen. Nach Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch mit 200 mL Ether geschüttelt. Im Scheidetrichter wurde ein dunkles Öl als untere Schicht abgelassen und mit Essigester in einem Becherglas umgerührt. Ein Produkt fiel aus, welches in konz. Ammoniak gelöst wurde. Nach Entfernen von Ammoniak wurde das Produkt auf einer Sephadexsäule (LH-20, Höhe 26 cm, Durchmesser 6,5 cm) mit 1% Ammoniak eluiert. Xanthopterin [6] und weitere Nebenprodukte wurden schnell eluiert, das gesuchte orangefarbene Produkt wurde nur langsam eluiert. Im Rotationsverdampfer wurde das eluierte Produkt eingeengt und in 50 mL heisser Ameisensäure gelöst. Mit 100 mL Wasser wurde verdünnt, so dass ein orangefarbenes Produkt ausfiel. Nach Abfiltrieren und Waschen mit Wasser, Ethanol und Ether wurde im Hochvacuum bei 40° C während 5 Stunden getrocknet. Die Ausbeute betrug 106 mg.

 

b) Dasselbe Produkt wurde auch erhalten, durch Versetzen von Erythropterin [10] mit Überschuss an Ethylendiamin in ameisensaurer Lösung. Die Ausbeute war jedoch wesentlich geringer.

 

  

 

 

 

4.4.21. 3-Methyl-5,6-dihydro-(1H)-pyrazin-(2)-on [126]

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In einen 200 mL Rundkolben wurden 30 g Ethylendiamin und 11,6 g Brenztraubensäureethylester gegeben. Es trat starke Erwärmung auf. Nach Abklingen der Reaktion wurde während 30 Minuten auf 100° C erwärmt. Im Rotationsverdampfer wurde bei 60° C eingeengt und das zurückbleibende Öl im Vakuum (0,01 mm Hg) bei 130° C destilliert. Das Destillat kristallisierte in farblosen Nadeln aus. Die Ausbeute betrug 15 g. Der Schmelzpunkt betrug 99,1° C.

 

 

 

 

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4.5. Literaturverzeichnis zum Experimentellen Teil
 

(200)   F. Kavanagh und R. H. Goodwin,., Archs biochem., 20, 315, (1949) (201)    P. B. Russell, R. Purrmann, W. Schmitt, G.H. Hitchings, Jour. Amer. Chem. Soc. 71, 3412 (1949)

(202)   A. Albert und H. C. S. Wood, Journal of appl. Chemisrty, 2, 591, (1952)

(203)   J. H. Bieri, W.-P. Hummel und M. Viscontini, Helv. Chim. Acta Vol. 59, Fasc. 7, p. 2374-2379 (1976)

(204)   G. B. Elion und G. H. Hitchings, Jour. Of Amer. Chem. Soc., 69, 2553, (1947)

(205)   R. Tschesche und F. Korte, Chem. Ber.84, 77 (1951)

(206)   M. Debono, R. M. Malloy und L. E. Patterson, Jour. of org. Chemistry, 34, 3032, 1969

(207)   Y. Iwanami T. Seki, Bull. Chem. Soc. Jap. 45 (9), 2829 (1972)

(208)   R. Purrmann, Liebigs Ann. Chem..548, 284 (1941)

(209)   M. Viscontini und H. Stierlin, Helv. Chim. Acta 46, 51 (1963)

 

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